آنزیم های پی سی آر , بایو ری ایجنت , PCR ENZYMES , BIOREAGENTS

   صفحه اصلی   |   درباره ما   |   مقالات   |   محصولات   |   تماس با ما

ناقل‌های ژن کلونینگ

در کلونینگ ژن برای انتقال ژن مورد نظر به سلول میزبان معمولاً لازم است که آن را وارد یک ناقل یا وکتور DNA ای کنند.
برای آنکه یک مولکول DNA به عنوان وکتور قابل استفاده باشد باید دارای مجموعه‌ای از خصوصیت باشد، شامل:

1. همانندسازی مستقل از سلول میزبان داشته باشد. به این دلیل که بتواند سریعتر از تقسیم سلولی تکثیر شود تا در نهایت نسخه‌های زیادی از آن تولید شود.

2. در هنگام تقسیم سلولی به سلول‌های دختری ( سلول‌های حاصل از تقسیم ) انتقال یابد.

3. اندازه‌ی کوچک در حدود 10 کیلوباز داشته باشد، چراکه مولکول‌های بزرگتر از این مقدار ممکن است در طی مراحل تخلیص و کلونینگ خرد شود و دستورزی آن نیز مشکل است.

از معدود مولکول‌های DNA ای که این ویژگی‌ها را دارا می‌باشند پلاسمیدها اند.


باکتری‌ها علاوه بر کرومزومشان دارای مولکول‌های DNA دو رشته‌ای، حلقوی و کوچکی هستند که قادر به همانندسازی مستقل از کرومزوم‌ باکتری می‌باشند. پلاسمید‌ها معمولاً حاوی 1 یا چند ژن می‌باشند که سبب ایجاد خصوصیات ویژه‌ای در سلول میزبانشان می‌شوند. پلاسمیدها را براساس نوع ژنشان گروه‌بندی کرده‌اند:

1. پلاسمیدهای بارور که به آنها F پلاسمید می‌گویند این پلاسمیدها حاوی ژنی اند به نام ژن tra که سبب انتقال اطلاعات ژنتیکی از طریق همیوغی به باکتری دیگر می‌شوند.

2. پلاسمیدهای مقاومت یا R پلاسمیدها که حاوی ژن‌های مقاومت به یک یا چند آنتی بیوتیک اند این پلاسمیدها در میکروبیولوژی بالینی مورد توجه‌اند چراکه فراوانی آنها در جمعیت باکتری‌ها، در انتخاب آنتی بیوتیک و درمان بیماری‌های عفونی اثر دارد.

3. پلاسمیدهای کشنده یا کولیسن سبب تولید پروتئین‌هایی می‌شود که برای باکتری‌های دیگر کشنده‌اند.

4. پلاسمیدهای بیماریزا مانند پلاسمید Ti در ارگوباکتریوم تومفسیانس که باعث گال در گیاهان دولپه‌ای می‌شود.

5. پلاسمیدهای تجزیه کننده که امکان تجزیه‌ی مولکول‌های غیر طبیعی نظیر تولوئن را به باکتری می‌دهند.

در کلون ژن، از خصوصیت مقاومت به آنتی‌بیوتیک به عنوان یک نشانگر انتخابی استفاده می‌کنند. نشانگر انتخابی در گزینش کلونی‌هایی که ‌DNA نوترکیب را دریافت کرده‌اند مورد استفاده قرار می‌گیرند.

باکتریوفاژها دسته‌ای دیگر از مولکول‌های DNA ای می‌باشند که به عنوان وکتور کلونینگ مورد استفاده قرار می‌گیرند. باکتریوفاژها ویروس‌هایی اند که باکتری‌ها را به طور اختصاصی آلوده می‌کنند.


فاژها مانند سایر ویروس‌های از یک بخش وراثتی، که شامل مولکول داکسی ریبونوکلئیک اسید(DNA) و یا ریبونوکلئیک اسید(RNA) است، و یک پوشش محافظتی پروتئینی به نام کپسید ساخته شده. ماده‌ی وراثتی فاژها در برگیرنده‌ی ژن‌هایی است که آنزیم‌های دخیل در تکثیر فاژ و پروتئین‌های سازنده‌ی کپسید را کد می‌کنند.

به طور کلی، برای آلوده سازی باکتری، ذره‌ی فاژی به دیواره‌ی باکتری می‌چسبد و ماده‌ی ژنتیکی‌اش را به درون سلول باکتری تزریق می‌کند. سپس مولکول DNA فاژی همانندسازی می‌کند و بعد از ساخت اجزای سازنده‌ی باکتری، ذرات فاژی جدید تشکیل می‌شود و سرانجام سلول لیز می‌شود که سلول را لیز می‌کنند و آزاد می‌شوند.

 

 بعد از تهیه‌ و طراحی ناقل مناسب و اتصال ژن مورد نظر به آن، DNA نوترکیب باید وارد سلول زنده شود تا با استفاده از دستگاه همانندسازی موجود در سلول، ژن هدف تکثیر و بیان شود.

عمل انتقال DNA نوترکیب به سلول زنده «ترنسفورماسیون» است و موجودی که از این طرق DNA نوترکیب را دریافت می‌کند تراریخت یا ترنسژنیک(Transgenic) نام دارد.


سلول‌هایی که معمولاً به عنوان پذیرنده‌ی مولکول نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرند، باکتری‌ها هستند چراکه رشد و تکثیر در باکتری‌ها به سرعت صورت می‌گیرد و کشت‌ آنها نیز ساده‌تر و ارزان‌تر است.


اکثر گونه‌های باکتریایی توانایی جذب مولکول DNA از محیط اطرافشان را دارند.‌ DNA خارجی در باکتری اغلب تجزیه می‌شود اما در صورت داشتن جایگاه شروع همانندسازی قابل شناسایی توسط سیستم همانندسازی باکتری، می‌تواند در سلول میزبان باقی بماند و تکثیر شود.

قدرت جذب DNA خارجی برای همه‌ی باکتری‌ها به یک میزان نمی‌باشد. به عنوان مثال باکتری اشرشیاکولی، که پرکاربردترین باکتری در مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی میکروبی است، در شرایط عادی قدرت جذب کمی دارد و میزان وقوع تراریختی در این شرایط مطلوب نخواهد بود. از این رو برای بهینه سازی میزان تراریختی باید باکتری را تحت تیمارهای خاصی قرار داد تا قدرت جذبش افزایش یابد.

در دهه‌ی 1970 با مشاهده‌ی اینکه سلول‌های ای.کولای خیسانده شده در محلول نمکی بسیار سرد، نسبت به سلول‌هایی که با محلول نمکی تیمار نشده اند، DNA را خیلی بهتر جذب می‌کنند، راه حل مشکل موجود در مرحله‌ی ترنسفورماسیون یافت شد. به این ترتیب که باکتری‌ها را در محلول کلرید کلسیم یا کلرید ربیدیوم با غلظت 50 میکرومولار قرار می‌دهند و سپس DNA نوترکیب را به باکتری تیمار شده می‌افزایند.

کلرید کلسیم تنها سبب اتصال DNA به دیواره‌ی باکتری می‌شود و به طور مستقیم در جذب DNA نقش ندارد. برای جذب واقعی DNA به درون سیتوپلاسم باکتری، آن را در معرض شوک حرارتی قرار می‌دهند که سبب افزایش نفوذپذیری دیواره‌ی باکتری می‌شود. حرکت DNA به درون باکتری با بالا بردن دمای انکوباتور تا 42°C تسریع می‌شود.

گام بعدی در کلونینگ ژن، شناسایی تراریخت‌ها است. از آنجا که در مرحله‌ی تولید DNA نوترکیب، تقریباً کنترلی در نحوه‌ی اتصال قطعه‌ی DNA به مولکول ناقل وجود ندارد، در پایان مرحله مخلوطی از انواع اتصال‌ها، از جمله؛ مولکول ناقل فاقد قطعه‌ی DNA ، قطعات DNA هدف متصل نشده به ناقل و مولکول‌های ناقلی که به صورت نامطلوب تولید شده اند، حاصل خواهد شد. همچنین در مرحله‌ی ترنسفرماسیون برخی سلول‌ها DNA نوترکیب را دریافت نمی‌کنند و کلونی حاصل از رشد آنها ژن مورد نظر را دربر ندارد. از این رو لازم است تا کلونی‌هایی که DNA نوترکیب مطلوب را دریافت کرده‌اند به طریقی شناسایی شوند. برای این منظور مهندسان ژنتیک، تکنیک‌های مختلف طراحی وکتورها یا ناقل‌های مورد استفاده در کلونینگ را متناسب با هدفی که در کلونینگ ژن دنبال می‌کنند، مورد استفاده قرار می‌دهند که در بخش دیگری به توضیح آن می‌پردازیم.


کلونینگ DNA کاربردهای متعددی دارد که در مجموع به آنها «مهندسی ژنتیک» گفته می‌شود که از آن جمله تعیین توالی ژنوم موجودات است که راه را برای تعیین توالی پروتئین‌های موجودات و استفاده از آن در مطالعه‌ی عملکرد پروتئین‌ها و مهندسی پروتئین می‌گشاید.

همچنین در تهیه‌ی «اثر انگشت DNA » برای تشخیص هویت، تشخیص بیماری‌های وراثتی، ژن درمانی، تولید پروتئین‌های نوترکیب، ایجاد موجودات تراریخت، تولید انبوه تجاری پروتئین‌های مختلف از جمله انسولین انسانی، هورمون رشد و آنزیم‌های مورد استفاده در صنعت کاربرد دارد.

فاژ لاندا


همان طور که در قسمت اول گفته شد از باکتریوفاژها نیز می‌توان به عنوان ناقل DNA هدف ژن کلونینگ استفاده کرد. از جمله فاژهای مورد استفاده در مهندسی ژنتیک، فاژ لاندا است که باکتری اشرشیاکولی را آلوده می‌کند.

وکتور‌هایی که از باکتریوفاژ لاندا ساخته می‌شوند برای کلون کردن قطعات DNA بزرگتر از 25 کیلوباز مناسب‌تر از وکتورهای پلاسمیدی اند. از این رو استفاده از وکتورهای مشتق از فاژ لاندا برای ساخت کتابخانه‌ی ژنومی ( مجموعه‌ی جامعی از قطعات DNA یا mRNA رونویسی شده از روی آنها، که نماینده‌ی ژنوم موجودات است) متداول‌تر است.

نحوه‌ی آلوده‌سازی فاژ لاندا به دو صورت می‌تواند باشد:

1. چرخه‌ی لیتیک- در این نوع رشد DNA فاژ در سلول باکتری همانندسازی می‌کند وبلافاصله سنتز پروتئین‌های ساختمانی ( پروتئین‌های تشکیل دهنده‌ی کپسید یا پوشش ویروسی) از روی آن آغاز می‌شود و اجزای تشکیل دهنده‌ی فاژ ( پروتئین‌های کپسید و DNA فاژی ) با هم جمع شده و تشکیل یک فاژ کامل جدید را می‌دهند. ذرات فاژی جدید با تخریب سلول باکتری آزاد می‌شوند.

2. چرخه‌ی لیزوژنیک- برخلاف چرخه‌ی لیتیک، که DNA فاژ در سلول باکتری باقی نمی‌ماند، در چرخه‌ی لیزوژنیک DNA فاژی به درون کرومزوم باکتری وارد می‌شود در این حالت به آن پروفاژ می‌گویند که شکل غیرفعال فاژ است. باکتری که به این صورت آلوده شده است را لیزوژن می‌گویند که از نظر ظاهری تفاوتی با باکتری‌های آلوده نشده ندارد. در حالت لیزوژنیک، فاژ باکتری را تخریب نمی‌کند و باکتری قادر به ادامه‌ی حیات خود است. زمانی که پروفاژ از کرومزوم باکتری خارج شود فعال می‌شود و چرخه‌ی لیتیک را آغاز می‌کند که در نهایت سبب تخریب سلول باکتری می‌شود. در شکل زیر نحوه‌ی آلوده ساز فاژ لاندا نشان داده شده:


فاژ لاندا شامل یک سرچندوجهی -که ‌ DNA فاژ در آن واقع شده- و یک دم -که با اتصال به دیواره‌ی باکتری در تزریق DNA فاژ به باکتری نقش دارد- می‌باشد. لانداDNA چهل و نه کیلوبازی و دورشته‌ای است و یک نسخه از آن به صورت خطی در قطعه‌ی سر فاژ قرار گرفته.

نکته‌ی جالب در مورد ژنوم لاندا وجود دو انتهای چسبنده مکمل در طرفین مولکوی خطی ‌DNA است. این دو انتهای چسبنده می‌توانند با یکدیگر تشکیل پیوند دهند و مولکول به شکل حلقوی مبدل شود.

ژنوم لاندا پروتئین‌های سازنده‌ی سر و دم، پروتئین‌های دخیل در همانندسازی و پروتئین‌های فعال کننده‌ی چرخه‌ی لیتیک را کد می‌کند. یکی از خصوصیات نقشه‌ی ژنتیکی لاندا این است که ژن‌هایی که در فعالیت‌های مشابه شرکت دارند در کنار یکدیگر واقع شده‌اند. می‌توان 4 منطقه روی آن تعریف کرد که به ترتیب قرارگیری عبارتند از: منطقه‌ی سری ( ژن‌های پروتئین‌های سازنده‌ی سر)، منطقه‌ی دمی ( ژن‌های پروتئین‌های سازنده‌ی پروتئین‌های دمی) منطقه‌ی همانندسازی، منطقه‌ی لیتیک.

ناحیه‌ی مرکزی ژنوم لاندا حاوی ژن‌های غیر ضروری در روند آلوده‌سازی سلول باکتری است که آن را خارج می‌نمایند و قطعه‌ی DNA خارجی را به جای آن وارد می‌کنند. این ناحیه‌ی غیرضروری شامل ژن‌هایی است که در وارد شدن فاژ به کرومزوم باکتری و خارج شدن پروفاژ از ژنوم باکتری فعالیت می‌کنند.
حذف این ناحیه از دو جهت سودمند است:

1. اندازه‌ی فاژ کوچک می‌شود و امکان اضافه نمودن DNA جدید با اندازه‌ی 25 کیلوباز را به ما می‌دهد.

2.حذف این ناحیه فاژ را غیر لیزوژنیک کرده و باعث می‌شود فاژ چرخه‌ی آلوده‌سازی لیتیک را دنبال کند و دیگر نیازی به القای فاژ برای تبدیل فاژ لیزوژنیک به لیتیک نیست.

بعد از وارد کردن قطعه DNA خارجی به ژنوم فاژ، آن را در پوشش فاژ بسته بندی می‌کنند و در مجاور باکتری‌های اشرشیاکولی قرار می‌دهند تا آلوده‌سازی صورت گیرد. باتخریب سلول باکتری پلاک‌‌هایی در محیط کشت حاصل می‌شود به این ترتیب کلونی‌های نوترکیب قابل شناسایی اند و دیگر نیاز به استفاده از نشانگر انتخابی، که در هنگام استفاده از پلاسمیدها لازم بود، نیست.

برای آنکه ژنوم نوترکیب لاندا در ساختمان سر فاژ قابل بسته بندی باشد کل اندازه‌ی آن نباید بیشتر از 52 کیلوباز باشد. در غیر اینصورت بسته بندی انجام نشده و ذرات فاژی آلوده کننده تشکیل نمی‌شوند.

برای رفع نواقص این نوع وکتور و کارایی بیشتر، مهندسین ژنتیک با ایجاد تغییراتی وکتورهای مختلفی از آن ساخته ‌اند.

فاژ M13

M13 یک باکتریوفاژ رشته‌ای است که متشکل است از DNA تک رشته‌ای حلقوی با طول 6.4 (6404 نوکلئوتید) که با کپسیدی حاوی حدود 2700 نسخه پروتئین P8 (پروتئین اصلی تشکیل دهنده‌ی کپسید) و 5 تا 8 نسخه از پروتئین P3 که در بخش تحتانی ساختمان فاژ واقع شده است.


M13 باکتری اشرشیاکولی را آلوده می‌کند. نحوه‌ی ورود M13 به سلول میزبان از طریق پیلی (pili) است. پروتئین P3 به گیرنده‌‌های واقع در نوک پیلوس1 متصل شده و سبب تزریق ‌DNA ویروس به میزبان می‌شود.


چرخه‌ی آلوده سازی M13 غیر لیتیک2 است و از این رو عفونت با آن برای میزبان کشنده نیست. از طرفی DNA تک رشته‌ای M13 وارد کرومزوم باکتری نمی‌شود و چرخه‌ی لیزوژنیک را دنبال نمی‌کند.


DNA تک رشته‌ای حلقوی M13 حاوی 10 ژن است برخی از این ژن‌ها به شرح زیر است:

• ژن II آنزیم نیکاز، که در همانندسازی چرخه‌ی غلتان نقش دارد را کد می‌کنند.

• ژن III پروتئین P3 را کد می‌کنند که ورود ژنوم فاژ را به سلول میزبان، رهبری می‌کنند.

• ژن VIII که P8 را کد می‌کند که سازنده‌ی اصلی پوشش ویروس است.

M13 در طی چرخه‌ی آلوده سازی خود دو نوع روش همانندسازی را ممکن است در پیش بگیرد:

1. مولکول تک رشته‌ای به عنوان الگو برای سنتز رشته‌ی مکملش قرار می‌گیرد و DNA دو رشته‌ای حلقوی تشکیل می‌شود که فرم تکثیری ژنوم M13 می‌باشد.

2. ذرات فاژی جدید به طور مداوم تشکیل می شوند و از سلول خارج می‌شوند. برای آنکه ذرات فاژی جدید تشکیل شود از طرق همانندسازی چرخه‌ی غلتان، DNA حلقوی تک رشته‌ای ایجاد می‌شود.

در همانندسازی چرخه‌ی غلتان، فرم تکثیری ( فرم دو رشته‌ای حلقوی ) از طریق آنزیم نیکاز،که توسط ژن II کد می‌شود، در یکی از رشته‌ها شکاف ایجاد می‌شود که سبب فراهم شدن دو انتهای آزاد 3" هیدروکسیل و 5" فسفات می‌شود. از آنجا که آنزیم DNA پلیمراز برای ردیف کردن نوکلئوتیدها به انتهای آزاد 3" هیدروکسیل به عنوان سوبسترا نیاز دارد، عمل آنزیم نیکاز این سوبسترا را برای آنزیم فراهم می‌کند. رشته‌ی بریده نشده به عنوان الگوی همانندسازی خواهد بود. در شکل زیر دو نوع همانندسازی نشان داده شده است:

اگر M13 را با فاژ لاندا مقایسه کنید متوجه‌ی ویژگی‌های منحصربه فرد آن می‌شوید برای مثال داشتن DNA حلقوی تک رشته‌ای که طول آن خیلی کوچکتر از ژنوم لانداست و این بدین معنی است که تعداد ژن‌های M13 کمتر است، به این علت که تعداد پروتئین‌های سازنده‌ی پوشش M13 تنها 3 نوع است در حالیکه در ساختمان سری دمی لاندا 15 نوع پروتئین وجود دارد.


از جمله خصوصیاتی که M13را مورد توجه مهندسان ژنتیک و طراحان وکتور قرارداده است به قرار زیر است:

• اولین خصوصیت، اندازه‌ی ژنوم M13 است. طول کمتر از 10 کیلوباز اندازه‌ی بسیار مطلوبی برای یک وکتور است، که در قسمت قبل این مجموعه علت آن بیان شد.

• ویژگی منحصر به فرد M13، فرم تکثیری دو رشته‌ای و نحوه‌ی همانندسازی آن است. فرم تکثیری M13 شبیه پلاسمید است و می‌توان مانندپلاسمید، وکتور حاصل از آن را از سلول میزبانش خالص نمود و مجدداً به باکتری وارد نمود.

یک ویژگی مهم و استثنایی وکتورهای حاصل از M13 توان بالقوه‌ی آن برای ایجاد DNA تک رشته‌ای از طریق همانندسازی چرخه‌ی غلتان است. تولید ژن کلون شده‌ی تک رشته‌ای برای برخی از اهداف از قبیل توالی یابی، ایجاد جهش به منظور بررسی‌های تکاملی و یا تولید پروتئین‌های با ویژگی‌های برتر، مورد توجه است.



1. پیلوس ساختار است که باکتری از طریق آن همیوغی جنسی انجام می‌دهد. پلاسمید F که حامل فاکتور بارور سازی است کد کننده‌ی پروتئین‌های لازم برای پیلوس همیوغ کننده‌ی اشرشیاکولی است.

2. چرخه‌ی لیتیک سبب لیز شدن سلول میزبان و مرگ آن می‌شود



 

 

 

مشاهده کاتالوگ

 

 

طراحی و میزبانی وب سایت : سباهاست